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蛋白质印迹（Western Blotting，WB）
today
protocols
immune
true

蛋白质免疫印迹（protein immunoblotting）

试剂和仪器

试剂

  1. PBS
  2. 高效RIPA裂解液（lysis buffer），-4℃
  3. WB及Co-Ip裂解液，-20℃
  4. 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液 http://www.ncmbio.com/product/show-138.html：-20℃，1: 100，
  5. BCA工作液：A液：B液= 50：1 苹果绿色
  6. 5 × loading buffer
  7. 电泳缓冲液
  8. 转膜缓冲液：700ml $ddH_2O$ ： 200ml 甲醇 ：100ml 10×转膜液 ，4℃冰箱预冷
  9. 1×TBST：1L ddH2O+ 10×TBS粉，取400ml定容至4L，[枪头剪去尖端，加入4ml Tween20，连枪头一起打入]{style="color:red"}，得到 1× TBST
  10. 封闭液：5%脱脂奶粉TBST溶液，2.5g奶粉+50mlTBST，
  11. 一抗、一抗稀释液、二抗、二抗稀释液
  12. 显影液：A液，B液

仪器

恒温摇床、冷冻离心机 参数 转速 半径、96孔酶标板

实验操作

蛋白提取

[所有溶液均应预冷，所有步骤应于冰上/4℃ 进行]{style="color:red"}

i. 将传代细胞培养皿放于冰上，弃去培养基，用预冷的PBS洗涤细胞3遍

<mark>细胞来源：动物信息、编号、性别、年龄、体重、清洁度、细胞株、基因信息</mark>

ii. 用纯水洗涤细胞刮

iii. 酶抑制剂: RIPA lysis=1；100 混合，加入培养皿，用细胞刮轻轻刮取细胞

iv. 充分裂解后，混合泳转移至1.5mL离心管

冷冻离心机4℃预冷，以14000g离心10min，分装上清到 至少2个新的1.5mL离心管。 [样品所有人姓名，样品制备或分装年月日，全部基本信息（批号、纯度、浓度）]{style="color:red"} 例如：AlexFluoro647-G3-(GfO)9,365 uM in ddH2O by UV@647nm,95%(MALDI),LY,2021.07.21

::: callout-tip 离心力F=m ω^2^ R 重力G=mg

相对离心力RCF =F/G = r ω^2^ /g =1.118×10^-5^ × r × rpm^2^

  • 相对离心力（relative centrifugal force，RCF），一般以g(重力加速度)的倍数来表示，g=9.801 m/s^2^ = 980.10 cm/s^2^

  • r为离心机转子半径，单位cm

  • $\omega=\frac{2\pi n}{60}$

{width="50%"} :::

BCA法蛋白定量

::: callout-note 二辛可宁酸/二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）

① protein + Cu^2+^ (碱性) → Cu^+^

② Cu^+^ + 2BCA → 紫色络合物 OD562 :::

  1. 96孔酶标板，2mg/mL BSA标准曲线

    {width="50%"}

  2. 每孔加入200 μL BCA工作液，梯度BSA蛋白，用ddH2O稀释10倍的样本蛋白

  3. 恒温37℃孵育30min 具体：恒温孵育 9日11:34至12:05

  4. 提前打开的酶标仪，ABS，562nm 具体：在562nm的紫外吸收（A1+A2+A3)/3=A平均

  5. 计算样品蛋白浓度 c (μg/μL)

蛋白变性

  1. 之前分装的样品protein：5×loading buffer=4:1稀释
  2. 95℃加热5分钟，冷却至室温

电泳

（低温，冰盒，电泳槽）[4℃]{style="color:red"}

  1. 计算上样量体积V (μL)，m=V × c × 10 × 4/5，$V=\frac{上样量(μg)}{c×8}$，单孔上样每次不超过20μL，总蛋白20-50μg，纯化蛋白100ng-2μg
  2. 预制胶，撕掉底部的红色封条
  3. 电泳液 MOPS+ 1L ddH2O，外槽用旧的达到下方刻度，内槽用新的加满至溢出，新的回收下次利用
  4. 缓慢垂直向上拔出点样梳，将上样孔的气泡赶尽
  5. 10微升移液器紧贴玻璃板缓慢上样，marker，从左到右依次减少
  6. （可选）阳性对照（前期检测结果正确的多余的蛋白质），阴性对照
  7. 连接电泳装置红对红，黑对黑，接通电源恒压100-140V，60min，内槽金属丝周围出现小气泡

湿法转膜

硝酸纤维素（NC）膜和聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，[4℃]{style="color:red"}冰袋

  1. 根据凝胶大小，剪切PVDF膜成适宜大小

    1. PVDF膜活化：甲醇帮助蛋白结合到膜上，膜由不透明变成均一的版透明，然后将膜放入提前配好的预冷的转膜液中平衡5min，边角剪切一部分标记以区分正反方向，使转膜后呈现 @fig-膜

      {#fig-膜 width="50%"}

  2. 电泳后的凝胶用水冲洗去电泳液，再用转膜液平衡3-5min

  3. 用硬塑料片撬开一面玻璃板，切除浓缩胶，留下含有目的蛋白的凝胶

  4. 转膜夹，海绵垫，滤纸，浸没在含有转膜液的托盘中，三明治结构：（黑色负极）黑色面，海绵垫，滤纸，凝胶（上面朝闭合处），PVDF膜，滤纸，海绵垫，白色面（红色正极），黑胶白膜

    {width="65%"}

  5. 流式管滚动赶尽气泡，用白色滑块夹上转膜夹

  6. 转移夹的黑面对转移槽的黑面，转移夹的白面对转移槽的白面

  7. 转膜槽中加入转膜液至没过”三明治“，盖上安全盖，放置冰盒

  8. 连接电泳装置红对红，黑对黑，接通电源恒流280mA，60-90min，

封闭

  1. PVDF膜放入TBST溶液，摇床50转速 振荡洗涤5min×3次

  2. 蛋白面向上，5%脱脂奶粉TBST溶液，2.5g奶粉+50mlTBST，回收-20℃

  3. 摇床50，室温1h或4°C过夜

  4. TBST洗涤，3min×3

    {width="50%"}

一抗孵育

特异性抗体 anti-内参，anti-目的蛋白

::: callout-tip 阳性对照（内部参照loading control 如 β-actin、GAPDH 或阳性血清）；

阴性对照（测血时用相应小鼠未免疫血清（即正常血）；

基因空载empty vector

基因过表达over expression

空白对照（不加一抗，用 PBS 代替）；

无关对照（用无关抗体）。 :::

  1. 塑料手套覆盖，根据分子量kD切割膜上的目的蛋白
  2. 一抗稀释液1：1000
  3. 蛋白面向上，摇床50，4℃过夜
  4. TBST洗涤，摇床100，3min×3

二抗孵育

碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或放射性核素标记的第二抗体

  1. 二抗稀释液1：4000~5000
  2. 摇床50，室温1h
  3. TBST洗涤，摇床100，5min×3

显影

  1. 配制显影液，A luminol： B H2O2=1：1
  2. 软夹镊子转移 膜
  3. 显影仪 电脑文件夹数据图像命名：姓名日期参数Marker/Samples 结果：具体数值/图像/现象/颜色

推荐阅读

  1. http://lsi.zju.edu.cn/2020/0210/c45388a1959437/page.htm

  2. 什么是TBS、TBST、PBS、PBST缓冲液有什么区别？

奇偶页法

左边写实验设计 假设 对照 原始数据 草图 现象

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